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电化学法测定生物活性

论文类型 技术与工程 发表日期 2006-12-01
来源 中国水网
作者 宋亚文,季民,伍洋,吕鸣祥
关键词 电化学法 微生物电极 生物活性
摘要 探讨了应用生物传感电极法测定微生物优势酶活性的可行性。以三乙醚三甘油酯及豆油乳液作为底物,通过测定微生物电极对底物的响应电流来测定微生物体内酯酶及脂肪酶(系)的活性。应用该方法测定厌氧和好氧反应器内生物膜及悬浮污泥的酶活性时发现,测出的酶活性量大小与单位质量污泥的有机物击除负荷紧密相关。在UASCB-MBBR串联系托中.好氧反应器中生物酶活性高于压氧反应器;在UASCB中,上部厌氧生物膜中酯酶活性高于厌氧污泥,而脂肪酶活性则是底部污坭床的污泥高于上部生物膜;在MBBR中,生物膜的酯酶及脂肪酶活性均高于悬浮

1 引言
  废水生物降解的实质是,基质通过活性污泥或生物膜中微生物细胞分泌的各种酶系的催化而逐步被氧化分解的过程.其中,催化剂以氧化还原酶系最为主要。因此,根据不同水质条件下微生物所产生的优势酶特性,可通过测定酶的催化能力大小来衡量微生物的活性。
  对于生物活性的测定分析,尚无统一的定量标准。目前提出的一些方法,如ATP法、脱氢酶法等,测定技术都比较复杂,过程也难以控制,不利于实际生产中推广应用。
  利用电化学的方法,运用微生物传感电极测定活性,目前在国内外文献中报道较少,本文将对此进行初步的研究和探索。
2 试验原理
  微生物活性是以微生物体内优势酶系的活性来表征的。由于酶的活性大小可由一定条件下它所催化的某一化学反应的反应速度来表示,所以酶的活性高低(实质上是酶的定量测定)表现在酶促反应的速度,即单位时间内底物或产物浓度的变化。
  酶促反应符合米氏公式,则有:
 
式中:V—— 酶促反应的反应速度;
   vm——酶促反应的最大反应速度
   Km——米氏常数;
   s— — 底物浓度;
   i——响应电流,与反应速度相一致。反应速度越快,响应电流越大。
  在一定范围内,1/i∝1/s呈线性关系,这个范围也称之为线性范围。随着s值的增大,i趋向于一个极限值,即底物浓度无限大时,达到了酶促反应的最大反应速度vm
  米氏常数K 表征了酶与底物的亲和力大小,它是酶自身所决定的,与温度、pH值、酶自身特性均有关。K 越小,酶与底物的亲和力越强。而酶促反应的最大速度vm则反映了酶活性的高低,vm越大,则酶活性越高。因此,微生物电极的活性主要采用酶促反应的最大反应速度vm表征。
3 试验方法
  本试验以天津某食品公司冰淇淋生产废水作为原水,生物处理主工艺为升流式厌氧污泥复合床(UASCB)一移动床好氧生物膜反应器(MBBR)。对试验原水水质的初步分析表明,冰淇淋废水中富含油脂和脂肪。油脂和脂肪的典型代表物为三乙酸三甘油酯和豆油乳液。试验中以配制的三乙酸三甘油酯和豆油乳液作为底物来测定微生物体内所含的酯酶和脂肪酶(类),得到了较好的响应曲线。
3.1 电极响应特性的测试
  通过测量化学反应体系的电流(密度)、电量、电极电位和电解时间等因素之间的函数关系来研究电极过程时,只需要简单的仪器设备,便能获得有关的电极过程动力学的参数。循环伏安法(CV法)是目前研究电极过程常用的方法。
  本试验主要栗用CV法,其电化学测试线路如图1所示。实验过程中介体为氧气时,其电位范围一般为250±500mV;介体为二甲胺基甲基二茂铁时,电位范围为100~400mV;介体为苯醌时,电位范围为100~400mV;介体为铁氰酸钾时,电位范围为550mV。电极扫描速度为25~100mV/s。实验中采用电解液为pH=6.0,7.5,8.0的0.2mol/L PBS缓冲溶液和pH=5.0 5.6的0.2rnol/L柠檬酸盐缓冲溶液。
  所有实验数据均为稳定后所测,

  电解池采有三电极体系,研究电极为铂片,面积为0.2cm ,参比电极为饱和甘汞电极(PTFE),辅助电极为镍丝,铂电极结构如图2所示。文中所有电板电位均指对于饱和甘汞电极(SCE)而言。

3.2 电极预处理
  将烧结好的Pt电极用5#金相砂纸打磨,然后用Al2O3抛光粉抛光至镜面,在超声波清洗器中清洗5min后将电极浸泡在lmol/LH2SO4溶液中煮沸5~10min,取出后将电极用二次蒸馏水洗涤,最后在lmol/LH2SO4溶液中以100mV/s速度在一250~250mV范围内对电极进行线性电位扫描,直至得到通常Pt电极的循环伏安图,且曲线稳定不再变化为止.取出用二次蒸馏水洗涤、待用。
3.3 微生物电极的制备
3.3.1 醋酸纤维素(CA)基膜的制备
  醋酸纤维素是一种羟基聚合物,是没有强烈氢键的无定形链状高分子化合物。它是一种非常优秀的制膜材料,具有很好的成膜和使用性能,这种材料制膜的潜力远远高于现在对它的认识。通过对CA作某些化学改性,能制备出新型膜。CA生物活性膜的形成采用了溶出一凝冻法,其和备过程如下:以二氯甲烷为溶剂于30℃ 下搅拌溶解CA,按配方加入无水乙醇、1,6.己二胺、并缓慢滴加50% 戊二醛溶液快速搅拌状态下反应1.5h。 在一定的溶剂蒸发条件下,将制膜液浇铸于10cm×10cm带罩光滑平板玻璃上,均匀展开,流延成膜,静置24h。待溶剂完全蒸发后,将膜小心的揭下,煮沸5~10min后即可待用。
3.3.2 微生物电极的制备
  从填料上刮下附着生长的微生物膜或吸取含活性污泥的悬浮液,取样的生物量均为5mg左右,滴加于基膜上,真空抽滤5~10min,外面再包覆一层基膜以防测试中微生物流失,用0型圈固定在Pt电极表面,制得微生物电极结构如图3。

3.4 豆油乳液的配制
  称取2gPVA热溶于80mL蒸馏水中.定容于100mL。量取13mL豆油与之混合.于恒温0~5℃冰水浴中超声波乳化约8h.储存于冰箱中待用。
4 结果与讨论
  本试验所制备的电极中的微生物分剐来自好氧生物膜、好氧悬浮污泥、厌氧生物膜和厌氧生物污泥。当进水容积负荷相同时,分别选取脂肪酶(系)和醇酶作为待测优势酶表征微生物电极活性,电极性能优劣如附表所示。
  从附表可以看出,无论是以三乙酸三甘油酯还是以豆油乳液作为底物,好氧微生物电极的vm值都远高于厌氧微生物电极。这表明好氧微生物电极的活性远远高于厌氧微生物电极活性。对比测试微生物的CODcr去除情况时还发现,进水容积负荷较低时,好氧微生物的活性较低,表明该系统中厌氧处理部分去除了废水中大部分的CODcr,抑制了好氧微生物活性,使其处于饥饿状态。这些与测试结果吻合,也就是说,证明了微牛物电极活性与微生物的其他活性参数有着良好的相关性。

附表:电极性能测试结果

待测优势酶对应底物 三乙酸三甘油酯 豆油乳液 性能参数 vm/μA 线性范围/mmol km/μA vm/μA 线性范围/mmol km/μA 厌氧 生物膜 33.6 10 8.3 20.55 0.8 1.73 微生物 生物污泥 11.12 6 2.71 33.79 0.7 9.508 好氧

生物膜

75.58 20 22.6 128.5 7 22.62 微生物 悬浮污泥 35.46 25 23.37 86.36 1.8 9.07

  此外,试验中还发现,好氧反应器内生物膜中酯酶和脂肪酶(类)的活性均高于其在悬浮污泥中的活性;厌氧反应器的生物膜中酯酶活性也高于其在厌氧污泥中的活性,而脂肪酶(类)活性却较厌氧污泥中低。这表明,厌氧处理时.污水中的酯类化合物主要为厌氧反应器上层的生物膜所分解,而脂肪酸则主要被UASCB下部污泥床的厌氧污泥所矿化。好氧处理时,悬浮污泥的密度大干填料,在能够维持填料转动的最小气量下,污泥集中在反应器下部,使得填料与污水的接触机会大大高于悬浮污泥,因而2种优势酶(系)在生物膜中的活性都高于悬浮污泥中的活性。


  真实废水中的优势酶系为脂肪酶(类)和酯酶。由于测定厌氧和好氧微生物电极响应时采用了不同的介体,为了减少由此带来的误差,我们将两部分分开来讨论。图4、图5所示分别为厌氧和好氧反应器中vm随去除负荷Nr增大的变化曲线。
  从图中可以看出,微生物优势酶系的活性与去除负荷具有相同的增减趋势;对应相同去除负荷的微生物电极.去除率高时,所对应电极的米氏常数Km值较小;厌氧去除负荷在15kg/m d时,无论是醋酶还是脂肪酶.其活性都发生了突变。根据在冰淇淋废水处理中的试验结果,厌氧去除负荷在15kg/m3·d时.其容积负荷亦为15kg/m3·d左右.试验测试表明,在此容积负荷下,CODcr去除率达到最大值,说明酵活性最高时,微生物的新陈代谢达到旺盛的顶点,有机物的去除最快,因而CODcr去除率也达到最大。
  因此,以微生物优势酶系活性作为测定参数的方法将大大简化生物膜(污泥)括性测定的试验步骤,对实现污水生物指标实时监测具有重要意义。

第一作者宋亚文.女,1971年出生。毕业于天津大学环境工程专业.工学硕士,工程师.现在北京市市政工程设计研究总皖工作。

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