消化污泥脱氢酶活性检测的若干问题

尹军
吉林建筑工程学院

　　摘要：在大量研究工作基础上，对检测消化污泥脱氢酶活性所涉及的内源代谢脱氢酶活性与基质代谢脱氢酶活性的区别、投加基质、样品前处理、酶反应终止剂、三苯基甲月替(TF)的萃取剂及其浓度问题进行了探讨。
　　关键词：脱氢酶活性；测定；消化污泥
　　中图分类号：X703
　　文献标识码：C
　　文章编号：1000-4602(2000)10-0047-03

　　脱氢酶是生物细胞内催化有机物氧化(脱氢)，并将其传递给最终电子受体的氧化还原酶，这类酶的活性可以通过加入人工受氢体的办法进行检测。通常用于检测脱氢酶活性的人工受氢体包括TTC、刃天青、亚甲基蓝以及INT等，其中研究和应用最多的是TTC试验。
　　TTC(2，3，5—氯化三苯基四氮唑)是最早被人们发现的人工受氢体，它首先是由Kuhu和Jerchel用于生化分析实验中的。自从Bucksteeg和Thiele提出TTC—试验以来，国外一些学者早在60年代就已将这一生化分析技术逐步应用到废水生物处理领域。70年代Klapwijk等和Ryssov-Nielsen在废水处理活性污泥法的研究中，都曾对TTC—试验作过改进。目前，国内有关文献资料所介绍的TTC—脱氢酶活性测定法，多与Klapwijk所提出的TTC—试验的改进方法有关。
　　80年代以来，国内外虽然也有利用TTC—试验进行活性污泥和厌氧消化污泥生化活性分析的报道，但由于TTC—试验中高温(90 ℃)萃取严重影响分析结果的准确度，致使该项生化分析技术的推广应用受到限制。为了建立稳定可靠、简便易行的TTC—脱氢酶活性测定方法，以便使TTC—脱氢酶活性测定技术在环境监测，特别是在水处理技术领域得到普遍应用，对检测好氧消化污泥脱氢酶活性所涉及的内源代谢脱氢酶活性与基质代谢脱氢酶活性的区别、投加基质、样品前处理、酶反应终止剂、三苯基甲月替的萃取剂及其浓度等问题进行若干探讨与分析。

　　1 内源代谢与基质代谢脱氢酶活性的区别

　　脱氢酶活性测定属于生物化学分析技术范畴，其实验过程设计和实验条件的选择，都应从生物学原理出发以及注意到检测样品的生物学特性。例如，消化污泥的生物学特性不同于活性污泥，从微生物呼吸类型方面看，其微生物维持生命活动的能量来源于细胞组成物质的氧化分解，即所谓内源代谢(Endogenous Metabolism)，而活性污泥微生物维持生命活动的能量来源于细胞内营养基质的氧化分解，即基质代谢(Substrats Metabolism)。另外，内源代谢过程总是伴随着不可生物降解物的积累和衰老细胞的溶解及其胞质释放，这些代谢活动的副产物及其残存的细胞碎片，使得污泥体系内各种成分更为复杂，而活性污泥在代谢活动过程中则无明显的上述情况。因此，消化污泥脱氢酶活性测定与活性污泥脱氢酶活性测定的实验过程及其条件必然有以下明显差别：①消化污泥样品前处理主要目的是去除内源代谢积累的副产物和细胞溶解物，而活性污泥样品前处理主要目的是去除混合液中的复合基质；②消化污泥样品培养在不加外源性基质条件下进行，而活性污泥样品培养则往往要加入人工配制的单一基质或复合基质；③消化污泥内源代谢速度缓慢，因此样品培养时间较长，而活性污泥基质代谢速度较快，样品培养时间较短；④消化污泥样品成分复杂，因此在选择酶反应终止剂时，需要考虑终止剂能否与样品中细胞残片或某种生物大分子发生颜色反应干扰比色分析的问题，而在选择活性污泥酶反应终止剂时，则无需注意此类问题。

　　2 测定中是否另加基质的问题

　　Bucksleeg和Thiele在测定活性污泥脱氢酶活性时，并没有加入有机基质，而Lenhard等人却在测定活性污泥脱氢酶活性时，向培养体系内加入了TTC—葡萄糖复合试剂。Altman对四唑盐作用原理和特殊脱氢酶活性应用方面进行了述评，认为TTC是唯一的一种被用来测定废水污泥普通脱氢酶活性的物质，一些研究者在恒温培养的样品中加入葡萄糖或乳酸盐等基质，实际上已经使测定过程特殊化了。例如，高浓度乳酸盐的加入，则意味着测定的是乳酸脱氢酶活性，而不是一般脱氢酶活性。Klapwijk等认为，样品中缺乏有机基质时，所测得的是内源呼吸的脱氢酶活性，而加入基质时，可测得最大基质呼吸的脱氢酶活性，基质的选择应该是活性污泥法污水处理厂进水的主要成分之一。他还用单一基质(如醋酸钠、乳酸钙、葡萄糖)和“混合基质”(含尿素、明胶、可溶性淀粉等)进行对比试验，结果证明乳酸钙是试验中最佳单一基质。笔者也曾对乳酸钙在脱氢酶活性测定中的作用问题进行了考察，发现加入乳酸钙比不加乳酸钙的测定值增加1.5～2.5倍。因此，在研究基质代谢速率及其与脱氢酶活性关系时，可以选用4.6%乳酸钙作为有机基质，而在研究活性生物量或消化污泥生化活性时，则不必外加基质。

　　3 测定样品的前处理

　　Klapwijk的方法没有对污泥样品前处理问题提出明确的要求；Ryssov Nielsen采用10%(pH＝7.5)磷酸盐缓冲液对活性污泥进行洗涤；日本学者泷田久宪在INT—脱氢酶活性测定时，曾用BOD稀释水反复洗涤活性污泥三遍，认为检测经洗涤后污泥样品的脱氢酶活性为内源性脱氢酶活性；国内有些学者则主张用生理盐水处理污泥样品，我们研究发现用纯水洗涤污泥样品测定脱氢酶活性的效果较好。通过纯水洗涤污泥样品，一方面可去除消化污泥中残存的基质和可溶性的细胞溶解物，有利于内源性脱氢酶活性的显现，另一方面能够调节污泥样品的pH，有利于TTC还原为甲月替(TF)。

　　4 酶反应终止剂的选择

　　Lenhard和Jones等曾采用乙醇和丁醇终止样品污泥的酶反应。Klapwijk等和国内一些学者均主张用浓硫酸终止酶反应，这是为了避免丁醇受热易蒸发的问题，并发现向样品中加1滴硫酸，便可立即停止酶反应，同时使污泥变得完全无色。另外，Ryssov-Nielsen在终止活性污泥酶反应时采用了物理方法，由于用硫酸来终止酶反应会使显色液褪色，背景值增大，特别是可使污泥龄较长的样品出现茶色反应，使空白值与样品值发生逆转，这种反常情况的出现可能与消化污泥内源代谢的自身特性有关。因此，我们通过实验比较了几种有机化合物终止酶反应的效果。实验表明，采用与培养液等体积的丙酮终止酶反应效果很理想，从未出现过像用硫酸终止酶反应的不良效果。但是需注意的问题是，如果脱氢酶活性检测中酶反应的终止与萃取步骤合并进行，那么采用丙酮终止酶反应是完全可以的，然而实际上要突破高温萃取测定结果不稳定这一技术难关，就不能将酶反应终止与萃取合并进行。正是为了这个目的，我们又比较了丙酮、乙醇与甲醇在消化污泥脱氢酶反应终止方面的作用效果，发现采用占培养液体积1/10的甲醛终止酶反应效果显著优于乙醇，但从空白值大小方面看，甲醛往往略大于丙酮，且在污泥浓度很高时，空白对照中还有程度不同的黄色素。由于甲醛对酶反应终止作用迅速，试剂用量少，因此选用甲醛作为酶反应终止剂是合适的。

　　5 萃取剂的选择

　　国外研究者曾采用过的萃取剂有甲醇、乙醇、丙醇，Klwpwijk等则选用丁醇作为萃取剂。国内学者陈颂原发现，丙酮和甲醛萃取TF的效果优于乙醇。我们的对比实验表明，丙酮不但萃取TF的效果优于甲醇、乙醇、异丙醇，而且萃取液颜色相当稳定，这可能与丙酮自身化学特性有关。据资料介绍，丙酮具有选择性溶解某些有机物的特性，且在水溶液中能够抑制物质离解。因此认为，丙酮应作为脱氢酶活性测定中TF萃取分离的首选试剂。
　　到目前为止，尚未发现有人提出或研究有关萃取剂浓度对萃取效果影响的问题。在Klapwijk等提出TTC—试验改进方法以后，国内一些文献资料几乎都是把TTC—试验中TF萃取温度定为90 ℃。这里实际上忽略了萃取浓度问题，操作上大都在酶反应终止剂加入的同时，立刻加入与样品培养液等体积的萃取剂进行90 ℃高温萃取，这样相当于萃取剂被稀释1倍。采用不同浓度丙酮水溶液于37 ℃条件下萃取消化污泥样品TF的结果表明，TF萃取效果受丙酮浓度影响，但并非100%丙酮萃取效果最佳。在丙酮浓度分别为100%、80%、60%、40%、20%的几组对比实验中，TF的最大测定值均发生在80%丙酮浓度条件下，60%丙酮萃取TF的测定值仅为最大测定值的58.36%。这个发现很重要，既为提高TTC—试验中TF检出量找到一种可行的技术途径，也为本项研究获得由高温萃取为常温萃取的突破性进展打下了基础。
　　在以往的TTC—试验中，Ryssov-Nielsen曾用溶菌酶破坏细胞壁的办法提高萃取效率。然而，其他学者为什么要采取高温条件下萃取TF呢?按照传统的观点来看，无非是说高温条件可以破坏细胞结构，改进细胞的透性，以利于萃取剂对TF结晶发生溶解作用。我们认为，除上述原因以外，高温条件实际上就是为了弥补萃取剂浓度不适，提高TF萃取能力不足而采取的强化措施。从这个观点上看，我们完全可以采取选择最佳萃取剂及其最适浓度的办法，将原有TTC—试验中高温萃取操作改进为常温萃取。按照这种设想，我们将终止酶反应后的样品培养液进行离心，弃去上清液，然后用丙酮于37 ℃条件下萃取TF，并与原有的TTC—试验进行对比，结果是前者的测定值高于后者，证明常温萃取TF是可行的。
　　在TTC—试验中，以常温(37 ℃)萃取TF代替高温萃取，是脱氢酶活性测定研究中的一项重大突破，这不但有利于提高脱氢酶活性检测分析方法的可靠性，而且必将会对脱氢酶活性测定这一生化分析技术的广泛应用起到积极的推动作用。

　　参考文献：
　　［1］Bienkinsopp S A,et al.…［J］.Water Research,1990，24(4)：441-447.
　　［2］俞毓馨，等.环境微生物检验手册［M］.北京：中国环境科学出版社，1990.
　　［3］周春生，尹军.…［J］.环境科学学报，1996，16(4)：400-405.

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　　收稿日期：2000-04-11