人工介质富集微生物对藻类和藻毒素降解试验研究

人工介质富集微生物对藻类和藻毒素降解试验研究

纪荣平¹,李先宁¹,吕锡武¹,朱光灿¹,张立将²,赵传鹏²,浦跃朴²
（1.东南大学环境工程系，江苏南京，210096；2.东南大学公共卫生学院，江苏南京，210009）

摘要：采用人工介质富集微生物对藻类和藻毒素的生物降解进行了试验研究。中试结果表明：在水力停留时间6～7d，源水叶绿素-a为15.3~266.1μg/L条件下，人工介质对叶绿素-a的去除率达59.4%。运用高效液相色谱（HPLC）对藻毒素进行了检测，当进水总藻毒素TMC-RR和TMC-LR分别为0.25~8.9μg/L、1.04~4.7μg/L，胞外藻毒素EMC-RR和EMC-LR分别为0.13~0.17μg/L、0.02~0.11μg/L时，人工介质对总藻毒素TMC-RR、TMC-LR和胞外藻毒素EMC-RR、EMC-LR平均去除率分别为47.9%、96.8%、41.5%、77%。PCR电泳图谱发现人工介质上富集有大量的假单胞菌属和芽孢杆菌属。通过人工介质富集微生物的方法可有效降解太湖水体中的藻类和藻毒素。

关键词：人工介质；溶藻细菌；假单胞菌属；芽孢杆菌属；藻毒素；生物降解

Study on biological degradation of algae and microcystins through the use of enrichment microbes by Artificial Medium

Ji Rongping¹，Li Xianning¹，Lv Xiwu¹，Zhu Guangcan¹，Zhang Lijiang²，Zhao Chuanpeng²，Pu Yuepu²

¹Department of Environmental Engineering，Southeast University,Nanjing 210096,China

²College of Public Health, Southeast University,Nanjing 210009,China

Abstract: Biological degradation of algae and microcystins（MCs） through the use of enrichment microbes by Artificial Medium was studied. The result showed that when chl-a in Taihu Lake was 15.3~266.1μg/L, 59.4% of Chl-a was removed within 6~7 days. High performance liquid chromatography （HPLC） analysis for detection of MCs was applied. When total microcystin RR and LR （TMC-RR and TMC-LR）、extracellular microcystin RR and LR （EMC-RR and EMC-LR） were 0.25~8.9、1.04~4.7、0.13~0.17、0.02~0.11μg/L in source water, average removal rates of TMC-RR、TMC-LR、EMC-RR、EMC-LR were 47.9%、96.8%、41.5% and 77% respectively. PCR electrophoresis chart finded that much algae-lysing bacteria as Bacillus.spp.and Pseudomonas.spp. were on the Artificial Medium. Algae and microcystin in the Lake Taihu caught be effectively degraded by enrichment microbes on the Artificial Medium.

Key words: Artificial Medium; algae-lysing bacteria; Bacillus.spp.; Pseudomonas.spp.; microcystin; biological degradation

0 前言

　　由于工业的高速发展，城市化进程的加快，工业废水和城镇生活污水的超标排放，特别是大量营养物质的排入，使太湖富营养化不断加重，全湖出现富营养化，局部水域出现有机污染和重富营养。富营养化引起藻类大量繁殖，其代谢物是饮用水消毒副产物的重要前体物，是饮用水处理中生物稳定性的不安定因素，尤其是许多藻类产生毒素，而传统制水工艺不能有效去除富营养化原水中的藻类和藻毒素，某些单元还可能引起藻细胞破裂，使水中溶解性藻毒素浓度增加，降低了饮水安全性^[1]。因此寻求能有效去除源水中藻毒素的处理方法，对保障居民饮用水健康具有十分重要的意义。
　　研究表明生物处理是藻毒素转化的主要途径。微囊藻毒素化学结构稳定，不易被真核生物和细菌肽酶分解，但由于其分子的Adda基团有不饱和双键，易被天然水体中某些特殊细菌降解而降低毒性^[2]。有研究发现：水体中一些细菌和微小动物对藻类及其有毒副产品的生物降解起着十分重要的作用^[3]，现已发现多种溶藻细菌、蓝藻嗜菌体和真菌能裂解藻类营养细胞或破坏细胞的某一特定结构^[4～7]。有人通过试验确证了自然水体中利用细菌等生物种属降解藻毒素的可能性，但自然降解速度较慢^[8~9]。国内的研究大多着重于生物预处理对水厂进水中藻毒素的去除效果，而对人工介质富集湖水中土著微生物的除藻和去除藻毒素的研究还未见报道。

1 试验装置与分析方法

1.1 试验装置
　　试验在太湖梅梁湾现场进行，试验装置分3格，每格长6m，宽1.2m，深1.8m，每格内安装1种人工介质，分别记为RZ、RT、RW。试验装置于2004年4月初通水，采用自然富集培养生物的方法进行挂膜。通过生物量和生物活性的比较，确定人工介质RZ为最优，下面主要讨论人工介质RZ对藻类和藻毒素的净化效果，其他两种人工介质的试验数据略。试验装置流程见图1。

图1 试验装置工艺流程图

1.2 分析项目和方法
1.2.1 水质分析项目有：叶绿素a、总藻毒素、胞外藻毒素。
1.2.2 叶绿素a的测定方法：采用0.45μm醋酸纤维滤膜过滤，用90%丙酮萃取，低温避光静置24h后用752N型紫外可见分光光度计测定在630nm、645nm、663nm、750nm四个波长下的吸光值，按公式计算叶绿素a含量^[10]。
1.2.3 藻毒素测定方法：采用高效液相色谱（HPLC）法。
　　（1）水样预处理：总藻毒素（TMC）检测水样：取500mL水样按5％比例加入冰醋酸，混匀过夜。用0.45µm whatman GF/C玻璃纤维膜过滤，滤液备用。胞外藻毒素（EMC）检测水样：取1L水样直接用0.45µm微孔滤膜过滤，滤液备用。
　　（2）水样中MC的富集净化：向已预处理的Superco C18固相萃取（SPE）柱中通入预处理后的水样，过柱速度为5mL/min；依次用40mL去离子水、20mL10％甲醇、20mL20％甲醇淋洗吸附了水样的C18 SPE柱，以尽量除去MC之外的杂质。
　　（3）MC的洗脱与定容：用5mL含0.1％三氟乙酸（TFA）的纯甲醇（色谱醇）分3次洗脱C18 SPE柱，将MC洗脱溶出于5mL带刻度的锥底管中；将锥底管置于45℃的水浴锅中，吹入净化的空气（经两层0.22µm微孔滤膜过滤），直至蒸发至约0.2mL，用含0.1％三氟乙酸（TFA）的纯甲醇定容至0.4mL；将定容后的样品用0.45µm的针头过滤器过滤，滤液装入样品瓶，-20℃保存待测。
　　（4）HPLC检测：采用Agilent 1100 高效液相色谱（HPLC）仪。主要配置：在线真空脱气机，四元混合泵，自动进样器，光电二极管阵列检测器（DAD），色谱柱：ZORBAX SB-C18柱（Agilent,5µm,4.6×150mm），流动相：甲醇及0.05%TFA水溶液进行梯度洗脱；流速：1mL/min；波长：238nm；加样量：20µL；柱温：40℃；标样：MC-LR，MC-RR（日本和光纯药工业株式会社），分子量分别为995.17，1038.21。
1.2.4 PCR（聚合酶链反应）检测：分别从装置中的人工介质上取单位质量的生物膜，保存于磷酸钠缓冲液（0.12M，pH8.0），－20℃备用。将采集到的人工介质在无菌条件下剪碎并放置于PBS溶液中，涡流振荡15min，超声15min，过滤。4500r/min离心15min，收集下层菌体沉淀。采用酚－氯仿法提取细菌总DNA，使用假单胞菌、芽孢杆菌的特异性引物进行扩增。

2 结果与讨论

2.1 人工介质RZ对藻类的净化效果
　　叶绿素-a是植物光合作用中的重要光合色素。通过测定浮游植物叶绿素，可了解人工介质对藻类的去除状况。试验期间（2004年4月～8月）源水叶绿素-a为15.3~266.1μg/L，出水为2.81~142.3μg/L，人工介质RZ对Chl-a的平均去除率为59.4％，详见图2和表1，除“水华”爆发期（8月4日至8月18日）外，其余时间出水叶绿素-a均小于20μg/L。

图2 人工介质RZ对叶绿素-a去除效果

2.2 人工介质RZ对藻毒素的净化效果
　　人工介质RZ对总藻毒素（TMC-RR和TMC-LR）、胞外藻毒素（EMC-RR和EMC-LR）平均去除率分别为47.9％、96.8％、41.5％、77.0％，详见表1，可见藻毒素-LR的生物可降解性较好，去除率较高，而藻毒素-RR的生物降解性能相对较差。藻毒素-LR被认为是目前发现的最强的肝脏肿瘤促进剂，而它的可生物降解性较好，这对于控制饮用水中藻毒素浓度具有积极的意义。当进水藻浓度较高时，出现了出水藻毒素-RR浓度高于进水浓度的现象，可能是装置内高浓度的藻类释放出较多的藻毒素，而人工介质未能及时有效降解的缘故。当藻浓度较高时，出水胞外藻毒素-RR超过0.5μg/L，但藻毒素-LR<0.5μg/L。

人工介质RZ对藻类和藻毒素的净化效果　　　　　 表1

2.3 人工介质对溶藻细菌的富集效果
　　首先应用PCR技术对太湖梅梁湾地区水体细菌相进行分析，发现了溶藻细菌－铜绿假单胞菌属（Pseudomonas aeruginosa）和芽孢杆菌属（Bacillus.spp）的存在，表明通过人工介质对特定溶藻细菌进行有效富集是可行的。其次在运行3个月后的3种人工介质上均发现有假单胞菌属（Pseudomonas.spp）和芽孢杆菌属（Bacillus.spp）的富集，其中介质RZ与介质RT对芽孢杆菌属（Bacillus.spp）的富集效果较介质RW明显；中层（水深0.9m）样本的含量较上层（水深0.0m）和下层（水深1.8m）样本多，详见图3。介质RT与介质RW对假单胞菌属（Pseudomonas.spp）的富集效果较介质RZ明显，同样是中层样本的含量较上层和下层样本多，下层样本含量最低，详见图4，这与下层的生物量和生物活性都较低是一致的，下层接近底泥，溶解氧较低，不利于溶藻细菌的生长繁殖。至于中层样本溶藻细菌较高的原因，可能与藻类在上升过程中首先被中层人工介质吸附，为溶藻细菌的生长繁殖提供了基质，关于溶藻细菌的溶藻机理，还须做进一步的研究。

图3 人工介质富集芽孢杆菌属效果比较　　　　　 图4 人工介质富集假单胞菌属效果比较

3 结论

　　（1）人工介质富集微生物对藻类和藻毒素降解试验研究表明，人工介质对Chl-a平均去除率达60％左右，对藻毒素-RR（包括总藻毒素和胞外藻毒素）的去除率为41～48％，藻毒素-LR的去除率为77～97％，当藻浓度较高时，出水胞外藻毒素-LR<0.5μg/L。通过利用人工介质富集湖水中土著微生物的方法可有效降解太湖水体中的藻类和藻毒素。
　　 （2）应用PCR技术对梅梁湾地区水体细菌相分析发现：天然水体中有溶藻细菌的存在，并在3种人工介质上均有假单胞菌属（Pseudomonas.spp）和芽孢杆菌属（Bacillus.spp）的富集，其中人工介质RZ的富集效果较其他两种介质明显；中层样本的细菌含量较上层和下层样本含量多。

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课题来源：科技部“十五”重大科技专项（863计划） 编号：2002AA601011－03
作者简介：纪荣平（1965—）男，江苏宝应人，副教授，在职博士生，主要研究方向为水处理理论及工程技术。
E-mail：rpji2002@sina.com