菊酯类、杂环类农药废水细菌降解研究

王 军 刘宝章 任久长
北京大学环境科学中心 10087

课题背景

　　农药废水的治理是目前环保工作的难点之一。新型化学农药一拟除虫菊酯类、杂环类农药，化学结构复杂，合成步骤多，中间体繁杂，致使这两类农药废水成分极其复杂，含有大量有毒或难降解的有机化合物，以及CN-、Cl-、SO42-等无机盐，对生物体毒害极大。在国外一般采用代价昂贵的、而且易造成二次污染的焚烧方法。在我国，这类农药的厂家大多建有生化处理装置，但目前几乎没有一家能够获得理想的处理效果。拟除虫菊酯类、杂环类农药低毒（对人畜）、高效、低残留量、环境相容性好，将逐渐取代有机磷农药。考虑到实际需要与将来应用前景，我们进行该类农药及其废水的微生物降解研究，并在南京第一农药厂进行现场试验。

研究方法

1、材料
　　土壤样采自南京第一农药厂废水处理车间排水口附近的砂土，剔除杂草杂物。
　　营养培养基：蛋白陈10g，牛肉膏5g，NaCl5g, 1000mLH2O中。pH值7.2。选择性培养基ＶＫ的无机盐溶液：K₂HPO₄ 0.1g,MgSO₄.7H₂O 0.2g,(NH₄)₂SO₄ 0.1g,CaSO₄0.04g,FeSO₄.7H₂O 0.01g,1000MlH₂O中。pH值7.2-7.4.综合有机废水取自南京第一农药厂集水池，有关性质见表1。

表1 有机废水的有关性质 COD(mg/L) BOD(mg/L) pH 盐度（%） CN-（mg/L) 1.0-2.0×10⁴ 2000-3000 10-12 4.0-6.0 30-40

　　吡虫啉、哒螨灵、溴氰菊酯、甲氰菊酯、醚醛、咪唑烷等成品农药来自南京第一农药厂，商品级。苯、吡啶，市购，化学纯级。
2、试验步骤
　　降解菌的富集：取10g土样加到1000mLＬ富集培养基中，调整pH值7.2左右，置于恒温振荡器上，30℃，120rmp连续震荡培养48小时。移取10mL活性培养液于100mL选择培养基中，置于恒温振荡器上，30℃，120rmp连续振荡培养48小时。从上述活性菌液中挑取、一环在VK固体培养基上划线，连续培养数天直至平板上出现明显可见的菌落。
　　液体转移培养：从平板上挑取单个菌落移入含10mL选择培养基（废水作为能源、碳源）的25mL小试管中，置于恒温振荡器上，30℃，120rmp连续震荡培养24小时。
　　废水降解试验：以10% 的接种量，将上述单株苗的24小时活性培养液转移交原底水与VK无机盐溶液不同配比的培养基中（250锥形瓶），置于恒温振荡器上，30℃，120rmp连续底物利用试验：在100mLVK无机盐溶液中分别添加：苯5mL,，吡啶0.5mL，醚醛2.0mL，二氯1.0mL，咪唑烷50mg，吡虫啉100mg，哒螨灵100mg，制成琼脂培养基。接种培养48小时的活性菌液0.1mL于上述含有不同底物的平板上。
　　HgCl₂的抗性试验：在以废水作为能源的VK选择培养基中分别加入一定量的HgCl₂,制成琼脂培养基。接种培养48小时的活性菌液0.1mL于上还含有不同浓度HgCl₂的平板质粒检测：质粒提取、分离采用碱裂解法，用琼脂糖凝胶电泳检测质粒。

结果与讨论

1、分离菌株的部分生理生化性状
　　通过富集、分离、纯化，最后筛选得到了3株能以有机废水作为唯一能源的降解菌株,其部分生理生化性状见表2。

表2 3株细菌的部分生理生化性状 菌株 需氧性 运动性 耐盐性（NaCl%) 对HgCl2的抗性（mg/L培养基） 1.0 5.0 10.0 15.0 20.0 W1 兼性 + 5.0 + - - - - W2 兼性 + ＜2.5 + + + + + W3 好氧 　 7.5 + - - - -

　　菌株W1、W2呈现兼氧性，在有氧条件下生长活跃，但在厌氧或缺氧条件下仍然能够存活，这种属性对于我们进一步的SBR工艺是有利的。现场的有机废水盐度相当高（4-—6%），对微生物生长有一定的抑制作用，菌株的耐盐性能也是十分重要的。W2菌株对HgCl2具有相当高的耐受力。
2、单株菌的降解谱
　　通过底物利用试验，考察了3株菌能够降解的化合物种类，见表3。

表3 3株菌对底物利用试验结果 菌株 苯 吡啶 咪啶烷 醚醛 溴氰 甲氰 吡虫啉 哒螨灵 二氯 W1 + + + - - - - - - W2 + + + - + + + + - Y3 + + + + 　 　 + 　 -

　　3 株菌能降解的化合物种类是不同的。对于农药中间体的基本基团，如苯、吡啶、咪唑烷等，3株菌都能降解。通过观察菌落最先出现的时间、生长速度、大小，发现W₁、Y₃对废水的利用情况较好，而ＷＺ能降解的化合物种类较多。

3、废水降解试验

3.1 单株菌降解能力
　　W1、W2、Y3对不同浓度废水的降解结果见表4。

表4 单株菌降解废水能力对比（一周） 菌株 起始COD=1600-1700mg/L 起始COD=3000-3500mg/L 终止COD（mg/L) COD去除率（%） 终止COD（mg/L) COD去除率（%） W1 895 46.1 2010 35.8 W2 1200 27.8 3060 14.8 Y3 1190 30.1 2360 28.5

　　可见，无论是在较低污染物浓度下（进水COD浓度1600-1700mg/L),还是在较高COD浓度条件下（进水COD浓度3000-3500mg/L），W1的降解效果均是最好的，Y₃次之，W₃对综合废水的降解能力较差，尤其是对高浓度的废水降解效果很弱。
3.2 混合菌降解试验
　　将3株菌的活性菌液按1:1:1的比例混合，接种到以废水为能源的体系中培养一定时间，荞得性质稳定的混合菌群。将这种混合菌培养至对数期，接种到不同浓度的废水体系中，使初始菌浓度达到2.0×108cells/mL，其降解效果列于表5。

表5 混合菌降解废水试验 时间（天） COD（mg/L） R（%） COD（mg/L） R（%） COD（mg/L） R（%） COD（mg/L） R（%） COD（mg/L） R（%） 0 1880 　 3220 　 6980 　 9520 　 11400 　 1 947 49.6 2110 34.4 5400 22.6 9020 5.3 11300 0.9 3 692 63.2 1190 63.0 3650 47.7 6970 26.8 8230 27.5 5 581 69.1 1170 63.7 3060 56.2 5720 39.9 7970 30.1 7 488 74.0 943 70.7 2320 66.8 4980 47.7 7430 34.8

　　混合菌的降解能力远远超过单株菌，其对有机污染物的耐受程度也大大提高，即使废水COD浓度高达6980mg/L时，一周后的去除率也有66.8%。
3.3 细菌的“协同”效应
　　混合菌的降解能力远远超过单株菌。推测，这3株菌对废水中的有机污染物的降解反应是相互补充的。将每株菌己经作用至降解平衡（7d）的废水体系等体积混合，在恒温振荡器上继续作用一定时间，考察其COD变化。
　　W1、W2、Y3菌液起始COD分别为1230、1580、1360mg/L，等体积混合后COD浓度为1330mg/L，其COD的变化情况见表6。

表6 单株菌“协同”降解效应 作用时间（天） COD（mg/L) COD去除率（%） 0 1330 　 1 1220 8.3 3 1090 18.0 5 1070 19.5 7 960 27.8

　　不同菌液混合后，体系COD浓度继续下降，可见单株之间是具有“协同”作用的。对作用7d后的茵液平板划线，观察结果表明，出现菌落最多的是W1菌株，可见W1菌株成为该生态体系中的优势菌种（predominant bacteria）人关于“协同”作用机理详见别处。
3.4 降解性质粒
　　分离菌株的碱裂解一琼脂糖凝胶电泳检测结果见图１。

　　结果表明，被检测的菌株均含有质粒，分子量大于1.5Kb。关于降解性质粒的稳定性、转移性、活性正在进一步的研究之中。
4、结论
　　（1）直接以有机农药废水作为唯一能源和碳源，具有较大的选择压力，分离、筛选得到的降解菌对于废水的降解有着较大的活性。
　　（2）单株菌的降解能力是十分有限的；由单株菌组成的混合菌的降解能力极大提高，单株菌对废水中污染物的降解反应是互补、具有”协同”效应的。
　　（3）已经证明，降解有机污染物的酶系大多数由质粒基因编码，因此，下一步的研究重点之一是3株菌的降解性质粒，包括质粒的稳定性、转移性及其在废水体系中的转移、表达等规律。